方法摸索優(yōu)化

目標優(yōu)化梯度條件，確定分析波長(cháng)。

1、 樣品溶劑選擇；

2、 濾膜吸附試驗；

3、 DAD檢測器下，波長(cháng)選擇主成分最大吸收或平臺處。

4、 分離條件選擇；

5、 色譜柱對比；（根據情況酌定）

6、DAD檢測器下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料（制劑研究時(shí)需同時(shí)進(jìn)行空白輔料破壞）等成分分離。

1、 一般在無(wú)參考標準或標準的方法無(wú)法直接套用時(shí),需進(jìn)行此項研究?jì)热?，?類(lèi)藥。

2、樣品溶劑：對樣品有很好的溶解能力，實(shí)驗室自然放置穩定存放12小時(shí)以上，與流動(dòng)相有良好的互溶效果。

3、續濾液峰面積達穩定最大值，續濾液體積在5ml以下時(shí)較為適宜，否則需要重新篩選溶劑。

4、破壞程度10%左右（5%—15%）為宜，2mol/l酸或堿90℃水浴12小時(shí)無(wú)破壞即視為樣品穩定，不必再追求降解度。4500lx光照48小時(shí)，樣品粉末及溶液需要同時(shí)做。破壞后的樣品溶液及空白溶劑均需調整至流動(dòng)相pH方可進(jìn)樣，可避免對色譜柱產(chǎn)生不良影響。如果破壞超過(guò)20%，需要降低破壞條件。

5、分離度良好，測定無(wú)干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

6、梯度變化要有*高洗脫能力過(guò)程，目的證明所有的雜質(zhì)成分均能夠被洗脫檢測。

7、方法摸索優(yōu)化實(shí)驗一般是不上資料的，只是體現在實(shí)驗記錄本中，除非是沒(méi)有方法依據時(shí)，如3類(lèi)藥申報時(shí)，梯度選擇及波長(cháng)選擇等均需要在資料中體現。

8、方法優(yōu)化完成后，最后在同一天同一人，用同一臺機器，對所有樣品進(jìn)行分析測定，具有可比性。

9、方法摸索優(yōu)化實(shí)驗采用工藝已經(jīng)確定的實(shí)驗室小試、實(shí)驗室放大樣品進(jìn)行，前期用于原料合成樣品配合檢測時(shí)，可以采用大范圍的梯度洗脫進(jìn)行模糊檢測分析。

專(zhuān)屬性

目的為了驗證方法對目標成分檢測的區分能力及全面的雜質(zhì)分析評價(jià)。

DAD檢測器或適宜的通用型檢測器下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料，各雜質(zhì)對照品等在同一天進(jìn)行分析，可以作為申報資料中雜質(zhì)譜的論述內容。

1、參照上述過(guò)程進(jìn)行破壞樣品制備，空白及陰性樣品都要做。

2、分離度良好，測定無(wú)干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

3、梯度要有*高洗脫能力過(guò)程。

4、以前期確定的分析條件及方法，在同一天同一人，用同一臺機器，對所有樣品進(jìn)行分析測定，具有可比性。

5、本部分數據進(jìn)資料，*佳采用生產(chǎn)線(xiàn)驗證的第1批樣品進(jìn)行。

當色譜條件與有關(guān)物質(zhì)檢查方法相同時(shí)，專(zhuān)屬性實(shí)驗數據可以共用。

出圖時(shí)主成分峰的紫外光譜圖及峰純度圖均要出圖。

檢測限

信噪比法，S/N≥3倍時(shí)的濃度為檢測限。

先進(jìn)空白，再進(jìn)對照品濃溶液（1mg/ml），在主峰相同位置處選擇空白溶劑1—2min范圍的基線(xiàn)積分得出峰高，按照峰高的3倍計算樣品濃度，直接用濃溶液稀釋至目標濃度附近即可，資料中體現至少3張圖（空白溶劑、濃溶液、及稀釋液）。

定量限

信噪比法，S/N≥10倍時(shí)的濃度為定量限。

按照基線(xiàn)峰高的10倍計算樣品濃度，直接用檢測限濃溶液稀釋至目標濃度附近即可，連續進(jìn)樣6針，計算峰面積RSD<2%（可以放寬至5%），資料中體現6張圖（6張稀釋液）。與檢測限在同一天做，出圖時(shí)縱軸標尺與檢測限一致，減少審評員審圖時(shí)的信息誤導，提高審圖效率。

線(xiàn)性與范圍

5點(diǎn)或7點(diǎn)法，酌情設置。

1、第一個(gè)點(diǎn)在定量限濃度，中間點(diǎn)為100%濃度，最后一個(gè)點(diǎn)為200%濃度（160%或180%），必須采用稀釋法，不得采用調整進(jìn)樣量的方式。r>0.999。

2、采用對照品進(jìn)行。

3、線(xiàn)性范圍一定要將回收率試驗的*高濃度包含進(jìn)去，否則回收率濃度超過(guò)線(xiàn)性范圍，缺乏定量依據，這個(gè)錯誤非常常見(jiàn)。

精密度

同一份供試品（樣品）溶液，連續進(jìn)6次。

1、計算峰面積RSD<2%，資料中體現7張圖（1張空白，6張樣品液）。

2、進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線(xiàn)驗證的第1批樣品進(jìn)行。

溶液穩定性

與精密度在同一天穿插進(jìn)行，實(shí)驗前進(jìn)行良好的排序設置，能共用的圖盡量共用減少工作量。以下時(shí)間點(diǎn)必做（除非已知穩定性情況可減少時(shí)間點(diǎn)）。

0、4、6、8、10、12、18、24。

1、實(shí)驗過(guò)程中可取精密度中的圖作為2h或4h，甚至6h。

2、做7至8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在撰寫(xiě)申報資料時(shí)最后以6個(gè)數據填報。

3、溶液穩定性數據至少做到16h穩定（盡量做得更長(cháng)時(shí)間，都是自動(dòng)進(jìn)樣，一個(gè)過(guò)夜就至少在12小時(shí)以上，時(shí)間太短無(wú)法證明溶液穩定性），極特殊情況下可以采用低溫進(jìn)樣器或特殊的保存方法或現配現分析等操作，但要求有數據作為支持依據，方可將特殊處理方法定入標準。

4、6個(gè)數據計算峰面積RSD<2%。

重復性

同一批號樣品，同一人員同法操作分別稱(chēng)取2份對照品及6份供試品（樣品）溶液，各進(jìn)1次。

1、計算含量RSD<2%，資料中體現9張圖（1張空白，2張對照，6張樣品）。

2、進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線(xiàn)驗證的第1批樣品進(jìn)行。

中間精密度

同一批號樣品，不同人員，不同設備，同法操作，分別稱(chēng)取2份對照品及6份供試品（樣品）溶液，各進(jìn)1次。推薦次日操作，避免產(chǎn)生壓針的疑問(wèn)（萬(wàn)一審評老師沒(méi)有注意到設備編號，所以別自找麻煩，推薦次日操作）。對照品也要重新稱(chēng)取。

與重復性的6個(gè)數據，共同參與統計，計算12個(gè)含量數據結果，RSD<2%，資料中體現18張圖，其中重復性9張，次日數據9張（1張空白，2張對照，6張樣品）。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線(xiàn)驗證的第1批樣品進(jìn)行。

準確度

采用回收率試驗方式進(jìn)行，通常采用直接回收率實(shí)驗法，按照80%、100%、120%比例分別稱(chēng)取樣品，同法操作，每個(gè)比例各3份樣品，各進(jìn)1次。

1、以中間精密度的含量均值作為理論含量，計算回收率，回收率變動(dòng)范圍98%—102%，回收率RSD<2%，資料中體現12張圖（1張空白，2張對照，9張樣品）。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線(xiàn)驗證的第1批樣品進(jìn)行。

2、原料藥采用直接回收率。

3、制劑采用加樣回收率測定：采用20片或粒制劑單位終產(chǎn)品混合研碎后，按比例稱(chēng)取進(jìn)行加樣回收，加樣回收率采用80%、100%、120%比例，1:1加入，加樣回收率不能達標時(shí)（輔料有吸附或干擾較大時(shí)），方可采用直接回收率。回收率變動(dòng)范圍98%—102%，回收率RSD<2%，資料中體現12張圖（1張空白，2張對照，9張樣品）。

耐用性實(shí)驗

改變色譜柱

不同品牌的色譜柱，共3個(gè)品牌。比較分離度，保留時(shí)間，含量測定結果。

如果品牌不足3個(gè)可采用多個(gè)批號或不同品牌多個(gè)批號的方式，不能采用廢柱子進(jìn)行實(shí)驗。

1、最好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)品牌的色譜柱共15張圖（每個(gè)色譜柱1張空白，2張對照，2個(gè)樣品各1張），各條件下的含量數據（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線(xiàn)驗證的第1批樣品進(jìn)行。

流動(dòng)相比例

流動(dòng)相的低組分比例變化約±5%。

1、最好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同比例的流動(dòng)相15張圖（每個(gè)比例1張空白，2張對照，2個(gè)樣品各1張），各條件下的含量數據（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線(xiàn)驗證的第1批樣品進(jìn)行。標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問(wèn)題無(wú)法確認。

流速變化

流速±10%。

1、最好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同流速的流動(dòng)相15張圖（每個(gè)比例1張空白，2張對照，2個(gè)樣品各1張），各條件下的含量數據（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線(xiàn)驗證的第1批樣品進(jìn)行。標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問(wèn)題無(wú)法確認。

不同pH

pH值±0.2

1、最好在同一天對倆份樣品溶液和兩份對照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同pH的流動(dòng)相15張圖（每個(gè)比例1張空白，2張對照，2個(gè)樣品各1張），各條件下的含量數據（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線(xiàn)驗證的第1批樣品進(jìn)行。標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問(wèn)題無(wú)法確認。

柱溫

柱溫±5℃

25℃、30℃、35℃

1、最好在同一天對倆份樣品溶液和一份對照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同溫度15張圖（每個(gè)比例1張空白，2張對照，2個(gè)樣品各1張），各條件下的含量數據（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線(xiàn)驗證的第1批樣品進(jìn)行。標準條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問(wèn)題無(wú)法確認。

0天樣品檢測

方法學(xué)研究結束且各項考察數據符合要求后，對3批生產(chǎn)線(xiàn)驗證樣品及被仿品在同一天進(jìn)行檢測。此數據在申報資料產(chǎn)品檢驗報告單中體現，且可作為穩定性的0天數據。

雙樣雙針。對照品也為雙樣雙針。