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熒光檢測器原理

更新時(shí)間:2022-08-03      點(diǎn)擊次數:4615
從電子躍遷的角度來(lái)講,熒光是指某些物質(zhì)吸收了與它本身特征頻率相同的光線(xiàn)以后,原子中的某些電子從基態(tài)中的zui低振動(dòng)能級躍遷到較高的某些振動(dòng)能級。電子在同類(lèi)分子或其他分子中撞擊,消耗了相當的能量,從而下降到電子激發(fā)態(tài)中的zui低振動(dòng)能級,能量的這種轉移形式稱(chēng)為NO輻射躍遷。由zui低振動(dòng)能級下降到基態(tài)中的某些不同能級,同時(shí)發(fā)出比原來(lái)吸收的頻率低、波長(cháng)長(cháng)的一種光,就是熒光。被化合物吸收的光稱(chēng)為激發(fā)光,產(chǎn)生的熒光稱(chēng)為發(fā)射光。熒光的波長(cháng)總要長(cháng)于分子吸收的紫外光波長(cháng),通常在可見(jiàn)光范圍內。熒光的性質(zhì)與分子結構有密切關(guān)系,不同結構的分子被激發(fā)后,并不是都能發(fā)射熒光。
在光致發(fā)光中,發(fā)射出的輻射總依賴(lài)于所吸收的輻射量。由于一個(gè)受激發(fā)的分子回到基態(tài)時(shí)可能以NO輻射躍遷的形式產(chǎn)生能量損失,因而發(fā)射輻射的光子數通常都少于吸收輻射的光子數,它以量子效率Q來(lái)表示。
在固定的實(shí)驗條件下,量子效率是個(gè)常數,通常Q小于1。對可用熒光檢測的物質(zhì)來(lái)說(shuō),Q值一般在0.1~0.9之間。熒光強度F與吸收光強度成正比.對于稀溶液,熒光強度與熒光物質(zhì)溶液濃度、摩爾吸光系數、吸收池厚度、入射光強度、熒光的量子效率及熒光的收集效率等成正相關(guān)。在其他因素保持不變的條件下,物質(zhì)的熒光強度與該物質(zhì)溶液濃度成正比,這是熒光檢測器的定量基礎。熒光檢測器屬于溶質(zhì)型檢測器,可直接用于定量分析。
熒光涉及光的吸收和發(fā)射兩個(gè)過(guò)程,因此任何熒光化合物,都有兩種特征的光譜:激發(fā)光譜(exitation spectrum)和發(fā)射光譜(emission spectrum)。
  熒光屬于光致發(fā)光,需選擇合適的激發(fā)光波長(cháng)(Ex)以利于檢測。激發(fā)波長(cháng)可通過(guò)熒光化合物的激發(fā)光譜來(lái)確定。激發(fā)光譜的具體檢測辦法是通過(guò)掃描激發(fā)單色器,使不同波長(cháng)的入射光激發(fā)熒光化合物,產(chǎn)生的熒光通過(guò)固定波長(cháng)的發(fā)射單色器,由光檢測元件檢測。zui終得到熒光強度對激發(fā)波長(cháng)的關(guān)系曲線(xiàn)就是激發(fā)光譜。在激發(fā)光譜曲線(xiàn)的zui大波長(cháng)處,處于激發(fā)態(tài)的分子數目zui多,即所吸收的光能量也zui多,能產(chǎn)生zui強的熒光。當考慮靈敏度時(shí),測定應選擇zui大激發(fā)波長(cháng)。
       一般所說(shuō)的熒光光譜,實(shí)際上僅指熒光發(fā)射光譜。它是在激發(fā)單色器波長(cháng)固定時(shí),發(fā)射單色器進(jìn)行波長(cháng)掃描所得的熒光強度隨熒光波長(cháng)(即發(fā)射波長(cháng),Em)變化的曲線(xiàn)。熒光光譜可供鑒別熒光物質(zhì),并作為熒光測定時(shí)選擇合適的測定波長(cháng)的依據。
另外,由于熒光測量?jì)x器的特性,使光源的能量分布、單色器的透射率和檢測器的響應等性能會(huì )隨波長(cháng)而變,所以同一化合物在不同的儀器上會(huì )得到不同的光譜圖,且彼此間無(wú)類(lèi)比性,這種光譜稱(chēng)為表觀(guān)光譜。要使同一化合物在不同的儀器上能得到具有相同特性的熒光光譜,則需要對儀器的上述特性進(jìn)行校正。經(jīng)過(guò)校正的光譜稱(chēng)為真正的熒光光譜。
激發(fā)波長(cháng)和發(fā)射波長(cháng)是熒光檢測的必要參數。選擇合適的激發(fā)波長(cháng)和發(fā)射波長(cháng),對檢測的靈敏度和選擇性都很重要,尤其是可以較大程度地提高檢測靈敏度。


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