液相色譜(HPLC)作為一種分離技術(shù)和方法，目前已經(jīng)發(fā)展到一個(gè)全新的階段。高精度的輸液泵，應用廣泛的色譜分離柱，低噪音、高靈敏度的各種檢測器和功能強大的數據處理軟件系統的出現，都推動(dòng)了液相色譜技術(shù)的迅猛發(fā)展。液相色譜儀正以它分辨率高、分析速度快和應用廣泛的優(yōu)點(diǎn)倍受儀器分析工作者的青睞，廣泛地應用于醫藥衛生、環(huán)境監測、食品檢測等領(lǐng)域。作者本人從事液相色譜分析工作二十多年，應用HPLC技術(shù)在血藥濃度、生物胺、核苷酸、蛋白質(zhì)濃度測定等實(shí)際工作中，積累了許多的方法和經(jīng)驗，在這里與大家交流，希望能對同行們有所幫助和借鑒，共同促進(jìn)液相色譜分析技術(shù)的發(fā)展。
 

　　1　液相色譜儀的基本工作原理
 

　　液相色譜儀如圖1所示，是由溶液貯器、高壓泵、進(jìn)樣系統、色譜分離柱、檢測器和數據處理系統幾部分組成。
 

　　高壓泵從溶液貯器中抽走流動(dòng)相，流經(jīng)整個(gè)儀器系統，形成密閉的液體流路。樣品通過(guò)進(jìn)樣系統注入色譜分離柱，在柱內進(jìn)行分離。柱流出液進(jìn)入檢測器，使已被分離的組分逐一被檢測器收集，并將響應值轉變?yōu)殡娦盘柡蠼?jīng)放大被數據處理系統記錄色譜峰，通過(guò)數據處理系統對記錄的峰值進(jìn)行存儲和計算[1]。
 

　　液相色譜儀是依靠色譜柱進(jìn)行分離的。研究證明：物質(zhì)的色譜過(guò)程是指物質(zhì)分子在相對運動(dòng)的兩相(液相和固相)中分配“平衡”的過(guò)程。液相色譜是以具有吸附性質(zhì)的硅膠顆粒為固定相，各種洗脫液為流動(dòng)相。當液體樣品在載體流動(dòng)相的推動(dòng)下，在液-固兩相間作相對運動(dòng)時(shí)，由于各組分在兩相中的分配系數(K)不同，則使各自的移動(dòng)速度不同，即產(chǎn)生差速遷移。各組分在兩相間經(jīng)過(guò)多次分配，從而達到使混合物分離的目的。
 

　　上式反映了物質(zhì)在兩相中進(jìn)行吸附、解吸、再吸附、再解吸…過(guò)程中，由于在兩相中濃度的不同，而存在分配系數上的差異。
 

　　既然分配系數及其差異是引起組分在液相色譜柱分離的根本原因，那么，必然地也會(huì )同色譜理論中可測宏觀(guān)量之間存在著(zhù)某種定量關(guān)系，事實(shí)上，色譜理論中通常用容量因子k’的概念來(lái)反映物質(zhì)在兩相中的分配關(guān)系k’值可以非常方便地表達組分在兩相的分配，又很容易從色譜實(shí)驗數據中直接測得，是色譜理論中重要的基本參數之一[2]。
 

　　2　輸液泵的常見(jiàn)故障及對策
 

　　輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統流路暢通、流量和壓力穩定的重要儀器部件，目前多用往復式恒流柱塞泵，主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個(gè)單向閥組成，用馬達帶動(dòng)凸輪驅動(dòng)柱塞桿作吸液和排液的往復運動(dòng)。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類(lèi)型。流動(dòng)相混合方式分為低壓混合和高壓混合。常見(jiàn)泵的故障主要有以下幾種，并提供解決的辦法。
 

　　2.1　單向閥故障 由于球與閥座密封不嚴，液體倒流，造成壓力不穩，甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴主要是污染或氣泡引起，球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。
 

　　為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染，流動(dòng)相應使用HPLC級的溶劑，并且配好的流動(dòng)相一定要用0.45u濾膜過(guò)濾和脫氣。如果泵被微粒污染，可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。沖洗時(shí)應打開(kāi)泄液閥，zui后再用所用的溶液沖洗整個(gè)系統。
 

　　氣泡進(jìn)入閥中會(huì )緊貼在閥體的一側，使寶石球難返回到閥座，引起倒流，泵的壓力和流速會(huì )明顯改變。此時(shí)，應立即打開(kāi)泄液閥，大流量(2ml/min)沖洗泵，直至排除液為直線(xiàn)型。因為甲醇可潤濕泵內壁，擠出氣泡，故也可使用脫過(guò)氣的甲醇沖洗泵。長(cháng)期不用的泵或新裝的泵頭應該用甲醇趕氣泡。泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡，即用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭，擰開(kāi)輸出管道的壓帽，手動(dòng)泵送液，可見(jiàn)到氣泡從孔中擠壓出來(lái)，直至無(wú)氣泡排出將壓帽擰緊[3]。
 

　　采取上述辦法仍不能使壓力穩定，應考慮是否密封墊壞了？或單向閥磨損、球不光滑等，需更換部件。
 

　　2.2　泵墊圈故障　泵墊圈常見(jiàn)的故障是滲漏和墊圈受損污染系統。液相色譜系統一般情況下不要使用強酸強堿溶液，因為這會(huì )損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運動(dòng)著(zhù)的柱塞桿緊密接觸，可使柱塞在泵頭自由運動(dòng)而流動(dòng)相不漏出來(lái)，它是液相色譜系統中zui易磨損的部件。有條件的實(shí)驗室可三個(gè)月更換一次墊圈，防止泵系統污染。如果用緩沖鹽作流動(dòng)相則更會(huì )加速墊圈的磨損，應及時(shí)沖洗。當墊圈損壞時(shí)，表現為：泵壓力不穩、泵頭漏液。一旦出現這個(gè)現象，應盡快更換新墊圈。
 

　　為避免上述故障的發(fā)生，我們在分析工作中應注意以下幾點(diǎn)：
 

　?、?使用超純水(18MΩ.cm)、純度級別較高的試劑和色譜級溶劑配制流動(dòng)相；
 

　?、?配好的流動(dòng)相一定要抽濾脫氣，即便儀器有在線(xiàn)脫氣裝置，也在上機前進(jìn)行抽濾。真空抽濾既過(guò)濾顆粒也脫了氣泡，非常有效。
 

　?、?泵在起動(dòng)前一定要通過(guò)泄液閥抽凈泵里的空氣。
 

　?、?用緩沖鹽洗脫時(shí)，分析結束后一定要用水沖洗泵和整個(gè)流路系統，不要讓腐蝕性溶液滯留泵中，zui后用有機溶劑充滿(mǎn)系統。
 

　　3　色譜分離柱的使用與維護
 

　　在前述儀器工作原理部分，我們已經(jīng)指出，液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實(shí)現的。我們目前工作中多采用反相色譜柱，如何保護好分離柱減少柱的污染是延長(cháng)柱壽命的關(guān)鍵。
 

　　3.1　怎樣維護好色譜分離柱
 

　　加保護柱(預柱)是保護分離柱的有效辦法。保護柱是根內裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱，接在分離柱之前，或代替流路過(guò)濾器。保護柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾，這些垃圾如果直接進(jìn)入分離柱會(huì )逐漸堆積在柱頭，zui終降低柱效能。保護柱是消耗品，如分析血漿樣品，一般分析50個(gè)樣品后需更換新柱芯。
 

　　避免高壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓，但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊，這將改變柱床體積，影響柱效。引起高壓沖擊的原因主要有：進(jìn)樣器的樣品閥的緩慢轉動(dòng)、泵啟動(dòng)太快、柱切換等操作。用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)的壓力變化不大，自動(dòng)進(jìn)樣閥由于切換較慢，可能會(huì )造成壓力沖擊。
 

　　合理選擇分離柱。我們知道，選擇色譜分離柱主要根據兩點(diǎn)，一是根據待測組分的分子量的大??；二是根據流動(dòng)相條件，包括PH值、離子強度和溶劑極性等。傳統硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流動(dòng)相PH值在3-7之間，PH值(>8)的流動(dòng)相能溶解硅膠，使鍵合相流失。而目前利用先進(jìn)的雜化顆粒技術(shù)研制的高純硅膠顆粒填料(如Waters公司的XTerra色譜柱)，集硅膠和多孔聚合物填料的優(yōu)點(diǎn)為一體，使有機硅烷單元取代了相當一部分占據顆粒內部和表面位置的硅羥基，使這種新型填料具有分辨率高、穩定性強、PH范圍寬(1-12)的優(yōu)勢，其性能突破了傳統液相色譜柱的極限。所以一定要根據分析的對象、流動(dòng)相的條件選擇合適的分離柱，茫然時(shí)可向公司的技術(shù)人員咨詢(xún)。
 

　　定期沖洗分離柱。每次分析工作結束時(shí)，沖洗完緩沖鹽后，zui后要過(guò)度到用強溶劑沖洗柱子，如可用色譜純甲醇、乙腈沖洗反相C18柱，目的是沖去吸附在柱上的強保留組分。如果用甲醇/水為流動(dòng)相也應這樣沖洗柱子，在一定程度上可恢復柱效。