液相色譜是一類(lèi)分離與分析技術(shù)，其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。在色譜技術(shù)發(fā)展的過(guò)程中.為了區分各種方法，根據固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名，如，紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。
 

　　對液相色譜儀的要求
 

　　1.流動(dòng)相必須用HPLC級的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45μm或更細的膜過(guò)濾)。
 

　　2.流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應該恢復到室溫后使用。
 

　　3.不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì )使單向閥粘住而導致泵不進(jìn)液。
 

　　4.使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20mL以上。
 

　　5.長(cháng)時(shí)間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相(如，甲醇等)，因為，純水易長(cháng)霉。
 

　　6.每次做完樣品后應該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。
 

　　7.C18柱絕對不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。
 

　　8.堵塞導致壓力太大，按預柱→混合器中的過(guò)濾器→管路過(guò)濾器→單向閥檢查并清洗，清洗方法：
 

　?、僖援惐甲魅軇_洗；
 

　?、诜旁诋惐贾虚g用超聲波清洗；
 

　?、塾?0%稀硝酸清洗；
 

　　9.氣泡會(huì )致使壓力不穩，重現性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。
 

　　10.如果進(jìn)液管內不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。
 

　　11.要注意柱子的pH值范圍，不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。
 

　　12.更換流動(dòng)相時(shí)應該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的
 

　　流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。
 

　　常見(jiàn)故障斷定及解決方法
 

　　(一)保留時(shí)間變化
 

　　1.柱溫變化：柱恒溫，必要時(shí)需配置恒溫箱
 

　　2.等度與梯度間未能充分平衡：至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱
 

　　3.緩沖液容量不夠：用》25mmol/L的緩沖液
 

　　4.柱污染：每天沖洗柱
 

　　5.柱內條件變化：穩定進(jìn)樣條件,調節流動(dòng)相
 

　　6.柱快達到壽命：采用保護柱
 

　　(二)保留時(shí)間縮短
 

　　1.流速增加：檢查泵,重新設定流速
 

　　2.樣品超載：降低樣品量
 

　　3.鍵合相流失：流動(dòng)相pH值保持在3~7.5檢查柱的方向
 

　　4.流動(dòng)相組成變化：防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀
 

　　5.溫度增加：柱恒溫
 

　　(三)保留時(shí)間延長(cháng)
 

　　1.流速下降：管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內氣泡
 

　　2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化：用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱
 

　　3.鍵合相流失：同前(二)3
 

　　4.流動(dòng)相組成變化：同前(二)4
 

　　5.溫度降低：同前(二)5
 

　　(四)出現肩峰或分岔
 

　　1.樣品體積過(guò)大：用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%
 

　　2.樣品溶劑過(guò)強：采用較弱的樣品溶劑
 

　　3.柱塌陷或形成短路通道：更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件
 

　　4.柱內燒結不銹鋼失效：更換燒結不銹鋼,加在線(xiàn)過(guò)濾器,過(guò)濾樣品
 

　　5.進(jìn)樣器損壞：更換進(jìn)樣器轉子
 

　　(五)鬼峰
 

　　1.進(jìn)樣閥殘余峰：每次用后用強溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗
 

　　2.樣品中未知物：處理樣品
 

　　3.柱未平衡：重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑(尤其是離子對色譜)
 

　　4.TFA(肽譜)：每天新配,用抗氧化劑
 

　　5.水污染(反相)：通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水
 

　　(六)基線(xiàn)噪聲
 

　　1.氣泡(尖銳峰)流動(dòng)相脫氣：加柱后背壓
 

　　2.污染(隨機噪聲)：清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑
 

　　3.檢測器燈連續噪聲：更換氘燈
 

　　4.電干擾(偶然噪聲)：采用穩壓電源,檢查干擾的來(lái)源(如水浴等)
 

　　5.檢測器中有氣泡：流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓
 

　　(七)峰拖尾
 

　　1.柱超載：降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相
 

　　2.峰干擾：清潔樣品,調整流動(dòng)相
 

　　3.硅羥基作用：
 

　　加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,鈍化樣品
 

　　4.同前(四)4同前(四)4
 

　　5.同前(四)35.同前(四)3
 

　　6.死體積或柱外體積過(guò)大：
 

　　連接點(diǎn)降至低,對所有連接點(diǎn)作合適調整,盡可能采用細內徑的連接管
 

　　7.柱效下降：
 

　　用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱
 

　　(八)峰展寬
 

　　1.進(jìn)樣體積過(guò)大：同(四)1
 

　　2.在進(jìn)樣閥中造成峰擴展L進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴散
 

　　3.數據系統采樣速率太慢:設定速率應是每峰大于10點(diǎn)
 

　　4.檢測器時(shí)間常數過(guò)大:設定時(shí)間常數為感興趣第一峰半寬的10%
 

　　5.流動(dòng)相粘度過(guò)高:增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相
 

　　6.檢測池體積過(guò)大:用小體積池,卸下熱交換器
 

　　7.保留時(shí)間過(guò)長(cháng):等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫
 

　　8.柱外體積過(guò)大:將連接管徑和連接管長(cháng)度降至最小
 

　　9.樣品過(guò)載:進(jìn)小濃度小體積樣品